iElisa 麻痹性貝類毒素（石房蛤毒素）檢測試劑盒

                                                                                      (C/N:CE606)

---湖南中檢維康生物技術有限公司

1．概要

石房蛤毒素（Saxitoxin，STX），已知毒性強的海洋生物毒素之一，為貝類神經(jīng)麻痹中毒（Paralytic shellfish poison，PSP）的主要毒素之一；石房蛤毒素，是四氫嘌呤的一種衍生物，對成年人輕度中毒量為110μg，致死劑量為540-1000μg。鑒于STX的高危害性和分布的廣泛性，世界各國均將其列為水產(chǎn)品安全檢驗的必檢項目。

2．原理

本試劑盒采用間接競爭法。酶標板微孔中預包被石房蛤毒素抗原，樣品中殘留的石房蛤毒素與微孔板上的抗原競爭石房蛤毒素抗體，加入酶標二抗后，用TMB顯色，吸光值與樣品中石房蛤毒素含量成負相關。

3．試劑盒組成

1）包被有抗原的96微孔板：1塊（96孔，12條×8孔）

2）標準品工作液：0、0.5、1.5、4.5、

13.5ng/mL        1 瓶x1mL

3）石房蛤毒素抗體： 1瓶x8mL

4）酶標二抗：        1瓶x15mL

5）10x濃縮洗滌液：        1瓶x50mL

6）樣本稀釋夜：    2 瓶x50mL

7）顯色底物液（TMB）：        1瓶x17mL

8）終止液：        1瓶x7mL

9）試劑盒說明書

10）質檢報告

4．需要的儀器、試劑

1）儀器

酶標儀450nm（iELisa全自動酶標儀或相當者）離心機微量移液器20μL～200μL，100μL～1000μL

、50mL 離心管→8道微量移液器酶標板振蕩器

天平：感量0.01g

2）試劑

去離子水

濃鹽酸

5．樣品處理

5.1貝類樣本

1）去除貝殼取出貝肉，將貝肉樣本均質；

2）稱取10g均質好的樣本于50mL離心管中；

3）加入20mL0.1M 鹽酸，劇烈震蕩混勻，沸水浴加熱5min；

4）待樣本冷卻后，室溫4000r／min離心10分鐘；

5）取上清液50μL到950μL樣本中，混勻；

6）取50μL混勻液用于檢測。

稀釋倍數(shù)：60

6．酶聯(lián)免疫分析程序

6.1測定之前注意事項

1）使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。

2）使用后迅速將試劑放入2-8℃冷藏。

3）在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4）所有孵育過程應避免陽光直射，并按要求用蓋板覆蓋住酶標板。

6.2 溶液的配制

1）洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用去離子水稀釋10倍后使用（1份濃縮洗滌液加9去份離子水）。

2）0.1M 鹽酸的配制：量取9mL鹽酸用去離子水稀釋至1000mL。

6.3測定程序

1）將足夠標準品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶標板架，標準品和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準品和樣品的位置。未使用的酶標板用鋁箔袋封好置2-8℃冷藏保存。

2）分別吸取50μL標準品和樣品加至相應的微孔（雙孔）中，然后各加入50μL石房蛤毒素抗體加蓋，室溫溫育30分鐘（每個標準品和樣品必須使用新的吸頭）。

3）倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證除去孔中的液體，然后每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中的液體，拍干；重復操作四次，洗板時每次間隔30秒，洗完后用力在吸水紙上拍干。

4）加入100μL酶標二抗抗體加蓋，室溫溫育30分鐘（每個標準品和樣品必須使用新的吸頭）。

5）倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證除去孔中的液體，然后每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中的液體，拍干；重復操作四次，洗板時每次間隔30秒，洗完后用力在吸水紙上拍干。

6）每孔加入100μL底物，室溫避光溫育10分鐘。

7）每孔加入50μL終止液，混勻。

8）置于酶標儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸光度值（OD值），參比波長630nm。（iELisa 全自動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值）。

7．結果判定

1）所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準品（0標）的吸光度值（Bo）再乘以100％，即百分吸光度值。百分吸光度值

以石房蛤毒素標準品濃度值（ppb）為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。

2）樣品的實際濃度為讀數(shù)結果乘以相應稀釋倍數(shù)。

3）如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一定的比例用稀釋緩沖液進行稀釋。

8．注意事項

1）室溫低于20℃或試劑及標本未回到室溫（20-25℃）會導致數(shù)值偏低。

2）在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3）標準物質和顯色液對光敏感，避免直接暴露在光線下。

4）混合要均勻（包括加樣品和標準液的時候都必需充分混合均勻）。

5）反應停止液為強酸性物質，避免接觸皮膚。

6）不要使用過期的試劑盒，也不要稀釋或攙雜使用不同生產(chǎn)廠家的試劑盒這樣會引起靈敏度降低。

7）試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。

9．檢測方法靈敏度、準確度、精密度、交叉反應率

1）精密度：批內變異系數(shù)＜10％(n=10)

批間變異系數(shù)＜25％（n＝10）

2）靈敏度：0.5ng／mL。

3）樣本檢測線：

貝類        30ng/mL

4）準確度：

貝類        90%±25%

5）交叉反應率：

 石房蛤毒素 100%